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單分子水平的動態結構生物學

許多蛋白質的結構已經使用 X 射線晶體學或冷凍電鏡等方法成功解決。 然而，當這些技術遇到本質上無序的蛋白質或不結晶的蛋白質時，問題就顯現出來了。 此外，觀察蛋白質在其原生環境中執行任務時的動態構象變化需要不同的方法。

在這里，諸如 FRET 和 FCS 等單分子熒光方法開辟了新的可能性，因為它們能夠在室溫下研究溶液中、甚至細胞中的單個分子，并有可能區分不同位置的亞種群。

smFRET 可以監測附著在不同蛋白質殘基上兩個或多個熒光標記之間的距離變化，從而提供有關構象變化、折疊或蛋白質相互作用的寶貴信息。 這補充了蛋白質結構模型和分子動力學模擬，使研究人員能夠更全面地了解蛋白質的功能。

納秒時間尺度上的 FCS (nsFCS) 揭示了本質上無序或折疊蛋白質的蛋白質鏈的重新配置時間。 將這些信息與聚合物物理理論和分子模擬相結合，可以更清楚地了解無序蛋白質動力學。

FCS 在微秒到秒的時間尺度上測量分子擴散行為，和實驗環境相關性非常高，可以很好的揭示蛋白質流動性、微環境，或蛋白質寡聚化和相互作用。

相分離驅動的細胞機制

液-液相分離正在成為調節細胞中生物分子空間組織的一種關鍵機制。 它的基礎是通過分子子集的凝聚來進行區域化分隔，從而促進蛋白質相互作用。 由于相分離是一個非常動態的過程，它對環境條件的變化反應非常迅速。

熒光方法可用于研究相分離的動力學，跟蹤分子進入不同相的分布，觀察不同相的動力學，并探究它們的不同性質:

FCS 可以用于測量標記物種的濃度；它的擴展應用FCCS 和 FLCS 甚至可以同時測量多個物種的濃度。此外，FCS 檢測了所研究分子的擴散速度，該擴散速度可能因相而異。

和局部環境粘度或剛度非常相關的分子旋轉運動，可以通過熒光各向異性實驗來進行觀察，從而對FCS進行很好地補充。

被稱為熒光傳感器的FLIM，可以實時讀取pH、溫度、膜張力或各種離子濃度等環境參數。 這種額外的信息維度，可以幫助解釋不同相的動態，并從物理角度理解它們的特性。

環境傳感

蛋白質在細胞內的原生環境的特性，例如分子擁擠、pH 波動或質膜改變，都會影響其功能。 但在許多情況下，并非所有這些參數都是已知的，因此無法在實驗中準確復現。

在過去的幾年里，已經研發出一系列的熒光傳感器，它們可以根據特定的環境變化，來改變它們的熒光壽命，例如溫度、鈣濃度、葡萄糖濃度或膜張力。通過 FLIM技術，可以以非侵入性方式從活細胞中實時定量讀取這些參數，從而為更好地了解蛋白質功能或調節提供背景。

細胞膜動力學和結構的映射

細胞膜是高度復雜和動態的結構。 它們的脂質和膜蛋白的分子組成經過精確調整，從而可以獲得其生理功能所必需的物理和化學特性。 可以結合互補的熒光方法從不同的角度對生物膜進行研究：

對帶有熒光標記的脂質或膜蛋白進行FCS，可以得到其擴散速度和蛋白質遷移率。它還可以表征在研究分子的濃度，而這些濃度可能因地點而異。

通過各向異性實驗，可以獲得分子取向及其變化。因此，各向異性成像可以可視化有序和無序的膜相，或監測分子的旋轉運動。

熒光壽命成像 (FLIM)

FLIM 是一種熒光壽命成像技術，可以解析和顯示單個熒光團的壽命，而不是它們的發射光譜。 熒光壽命定義為分子在通過發射光子返回基態之前保持在激發態的平均時間。 由于熒光壽命與濃度、樣品吸收、樣品厚度、光漂白和激發強度無關，因此與基于強度的方法相比，FLIM 不易出現偽影。

FLIM 的優勢：
. 可用于區分不同的熒光團
. 提供額外的信息維度
. 作為光譜信息的補充
. 成為多種功能成像的首選技術（因為熒光團的壽命會受到環境參數，例如 pH 值、離子或氧濃度或分子結合的影響）

FLIM-FRET – 基于壽命的 F?rster 共振能量轉移

FRET 是一種非輻射過程，其中來自激發的熒光分子（供體）的能量轉移到附近2-10 nm 范圍內的非激發熒光團（受體）。 能量轉移導致供體猝滅、兩個熒光團的熒光強度發生變化，以及供體壽命的縮短。

與測量熒光強度變化的標準 FRET 相比，基于壽命的 FRET 可以通過使用供體分子的熒光壽命作為探針進行定量分析，該熒光壽命與寬范圍內的濃度無關。 這是至關重要的，因為在像細胞這樣的生物系統中，熒光團濃度通常不能精確地測定，也不能在不同細胞之間進行比較。

FLIM-FRET的優勢：基于壽命的FRET可以識別具有不同FRET效率的不同亞群，然而基于強度的FRET只能檢測平均值。

smFRET – 單分子 F?rster 共振能量轉移

在這種類型的實驗中，要么在單個分子（包含一個供體和受體）內觀察到 FRET 過程，要么在自由擴散通過固定在表面上的共聚焦區域相互作用的分子之間觀察到 FRET 過程。

一種對 smFRET 很有幫助的技術是脈沖交錯激發 (PIE)，其中幾個脈沖激光器是同步的。 激光脈沖在納秒時間尺度上分離，從而允許同時記錄樣品分子的時間行為。

在 smFRET 實驗中，可以用于交替激發供體和受體。 通過這種方式，受體染料獨立于 FRET 過程被激發，以確認其存在和光活性。 缺乏活性供體或受體的分子與活性 FRET 復合體中分離出來。 這使得即使具有非常低 FRET 效率的 FRET 分子，也可以與具有不存在或不發熒光的受體的分子區分開來。

熒光相關光譜 (FCS)

熒光相關光譜 (FCS) 是一種利用熒光強度隨時間波動進行相關性分析的熒光光譜技術。 它為引起這些特征波動的光物理學以及檢測到粒子的擴散行為和絕對濃度提供了極具價值的參考信息。 FCS 能夠測定重要的生化參數，例如顆粒（分子）的濃度、大小或形狀或其環境的粘度。

熒光壽命相關光譜 (FLCS)

熒光壽命相關光譜 (FLCS) 是一種利用皮秒時間分辨熒光檢測來分離不同 FCS 貢獻的方法。
在熒光互相關光譜 (FCCS) 中使用壽命不同、光譜不可分離熒光團時，FLCS 具有特別的優勢，因為它可以消除光譜串擾和背景噪聲。 它還提供了一種解決探測器后脈沖偽影的方法。

熒光互相關光譜 (FCCS)

熒光互相關光譜 (FCCS) 是根據不同的發射光譜區分來自兩種不同物種 FCS 信號的方法。

各向異性成像

穩態熒光各向異性、特別是時間分辨熒光各向異性的測量為研究分子取向和流動性以及影響它們的過程提供了極好的可能性。 一般來說，各向異性不依賴于熒光團的濃度，即與檢測到的信號強度無關。這對于解釋 smFRET 測量特別重要，其中熒光團遷移率可能會影響共振轉移效率。 時間分辨各向異性測量提供更多信息，因為穩態測量僅為時間平均值，而沒有直接洞察動態的過程。

使用 PAINT 和 dSTORM 為超分辨率 FLIM 修改的自定義模式

Luminosa 為方法開發提供了一種定制模式，其中每個光機組件都可以通過軟件完全訪問，并且可以自由選擇參數。

利用這種模式超越了標準的 FLIM，展示了超分辨 FLIM。一方面，與弗里堡大學的 Guillermo P. Acuna 研究小組合作進行了 FLIM-PAINT 成像，另一方面，與哥廷根大學的 J?rg Enderlein 小組合作進行了 FLIM-dSTORM 成像。

單分子定位顯微鏡（SMLM）通過依次定位單個分子并隨后合成超分辨圖像，可提供空間分辨率超過衍射極限的圖像。分子在亮態和暗態之間切換的機制各不相同，因此每幀圖像只能定位一小部分分子。其中一種是納米尺度地形圖成像的 DNA 點積累（DNA-PAINT），它使用熒光標記的短寡核苷酸與互補的、目標結合的 DNA 分子瞬時結合。另一種方法是直接隨機光學重構顯微鏡（dSTORM），在這種方法中，熒光團會閃爍，即隨機開啟、發射，然后迅速恢復到暗態。

在共聚焦成像中，掃描區域、像素數量和像素停留時間共同決定了每幅圖像的采集時間。對于 PAINT，這需要與 DNA-PAINT 成像鏈的結合動力學相匹配，從而使采集時間大大小于平均結合時間。對于 dSTORM，則應根據熒光團的閃爍動力學來調整采集時間。

按照 SMLM 測量的通常做法，對由此產生的共焦 FLIM 圖像系列進行分析，以獲得最終的超分辨圖像。最后，對每個單分子事件的光子到達時間進行檢索和分析，以獲得壽命對比度。

FLIM-SMLM 的優勢:

• PAINT 或 dSTORM 帶來的空間超分辨率
• 聚焦切片能力
• FLIM 帶來的附加壽命對比，用于多路復用或 FRET
• 使用單激發激光的傳統商用顯微鏡
• 可提供用于長時間測量的保持聚焦選項

InstaFLIM

• 快速分析，用戶交互最少
• 4 種不同的分析程序并行運行：多指數衰減擬合、相量圖、模式匹配和壽命直方圖
• FLIM 物品種類分離的建議
• 建議的參數可以微調

InstaFCS

• 實時計算自相關和互相關曲線
• 在線 FCS 擬合，自動提供模型和參數建議
• 包括相關曲線的標準差

FRETcompass

• 效率與化學計量直方圖的在線預覽
• 自動測定單分子 FRET 實驗中使用的校正因子
• 基于 2018 年發布的社區基準研究
• 所有通道中僅供體、低 FRET 和高 FRET 群體的熒光壽命衰減

LumiFinder

• 自動檢測和測量固定式發射器
• 用于單分子研究，尤其是單分子 FRET 測量
• 根據可調節的選擇標準，定位固定化發射器
• 在已識別的位置進行點測量，可定義測量時間
• 在線預覽每個點采集的數據

大樣品成像

• 螺旋掃描：在 DIC、外延照明或透射模式下創建概覽，覆蓋樣品中幾平方毫米的大面積區域。
• 參考圖：對于選定區域或感興趣點的進一步測量，并保存它們的空間關系以供分析
• 矩形區域的平鋪和拼接
• 保持對焦功能

無樣品自動對準

• 確保每次測量的最佳性能，即使是最具挑戰性的測量
• 只需單擊一下即可實現一致性

校準激發 (CalEx)

• 激發激光功率校準允許以 μW 為單位設置和顯示激發強度
• 無需外部功率計

可變PSF (VarPSF)

• 在衍射極限和更大的觀察體積之間切換
• 用于 FCS 和單分子 FRET 實驗
• 使用自定義模式進行點變化 FCS 測量

NovaFLIM

• 基于 GPU 加速算法快速分析 FLIM、FLIM-FRET 和各向異性數據
• 對 z 堆棧、延時序列和拼接圖像進行高效批量分析
• 先進、靈活的 ROI 處理
• 結合擬合參數直方圖進行可重復的 ROI 選擇

尖端硬件

• 基于倒置顯微鏡的共聚焦系統
• 激光波長為 375 至 1064 nm 的多功能激發系統
• 掃描選項：FLIMBee 振鏡掃描儀和壓電物鏡掃描（成像速度或單分子研究的最高靈敏度）
• 多達 6 個真正并行的檢測通道，帶SPAD和/或混合 PMT
• 每個通道< 700 ps死區時間和5 ps的時間間隔

具有更高分辨率和更高對比度的功能成像

將圖像掃描顯微鏡 (ISM) 的分辨率增強和對比度提高與 FLIM 的功能信息相結合。

無縫集成

專為 Luminosa 設計，確保完美的兼容性、優化的性能和強大的日常處理能力，包括簡化的自動對準功能。

可定制的研究工具

利用開放式硬件和（.ptu） 數據格式，憑借 25 年的時間分辨光子檢測經驗，自信地為您的研究目標創建和調整新的時間分辨方法。探索 SPAD 陣列在成像、波動分析和單分子熒光模式方面能帶來什么。

精度與兼容性的完美結合

PDA-23 探測器與MultiHarp 160 TCSPC 模塊完美匹配.
PDA-23:

• 大有效填充因子
• 光子檢測效率高
• 時間分辨率低于 100 ps
• 暗計數率低

• 多達 64 個獨立輸入通道
• 5 ps 時間分辨率
• 650 ps 的超短死區時間，跨通道無死區時間

體驗ISM和FLIM的協同作用

將圖像掃描顯微鏡（ISM）增強的空間分辨率和通過抑制焦外光而大幅提高的對比度與 FLIM 豐富的功能信息和多路復用可能性相結合。通過這種協同作用，可以更深入地探索細胞動力學和分子相互作用，提供傳統共聚焦系統以前無法提供的細節。

真正實現所有通道的同步采集

Luminosa 的獨特之處在于，PDA-23 探測器和其他點共聚焦探測器可以并行使用，以實現高分辨率和參考通道的多路復用。

ISM 的優勢

• 每個陣列元件近似于零尺寸的共聚焦針孔
• 增加光學切片
• 像素重新分配后分辨率提高約 30%
• 對于 485 nm 激發：像素重新分配后分辨率低至 155 nm FWHM，去卷積后分辨率低至 120 nm FWHM
• 用于提高對比度的計算切片

用于ISM-FLIM的Luminosa軟件功能

• 在線像素代碼重新分配
• 自動確定偏移向量
• 在線壽命對比
• 用于標記物多重檢測的 FLIM 分析